Citogenetica

La citogenetica è quella branca della genetica umana che studia il patrimonio cromosomico degli individui (cariotipo) allo scopo di identificare la presenza di eventuali anomalie che sono alla base di condizioni patologiche specifiche o di riduzione della fertilità. Lo studio dei cromosomi può essere eseguito sia in epoca prenatale sia in epoca postnatale:

  • L’analisi del cariotipo in epoca prenatale viene eseguita sulle cellule del liquido amniotico o su quelle dei villi coriali e permette di conoscere in modo certo se il feto è affetto da alterazioni del patrimonio cromosomico. L’esame citogenetico consiste nella visualizzazione dei singoli cromosomi attraverso l’acquisizione di immagini fotografiche che vengono memorizzate ed analizzate al computer. Questo permette di evidenziare eventuali anomalie cromosomiche sia numeriche (trisomie e monosomie), sia strutturali, come traslocazioni, delezioni, duplicazioni ed inversioni.
  • In epoca postnatale l’analisi del cariotipo viene generalmente eseguita sui linfociti del sangue periferico e permette di riconoscere anomalie cromosomiche che si associano ad una condizione patologica, ad una riduzione della fertilità o ad una maggiore probabilità di generare figli affetti da patologia cromosomica.

Le analisi in epoca prenatale

Cariotipo su Villi Coriali

  • Metodo semi-diretto e allestimento dei preparati cromosomici
  • Coltura a lungo termine e allestimento dei preparati cromosomici (Quantità minima per l’allestimento della coltura a lungo termine: ≥ 5 mg)
  • Diagnosi citogenetica con tecnica di colorazione differenziale Giemsa Standard e GTG
  • Allegato fotografico del cariotipo fetale mediante appaiamento dei cromosomi omologhi.

Cariotipo su Cellule del Liquido Amniotico

  • Colture cellulari “in situ” ed allestimento dei preparati cromosomici
  • Determinazione immunoenzimatica dell’alfa-fetoproteina.
  • Diagnosi citogenetica con tecnica di colorazione differenziale Giemsa Standard e GTG
  • Allegato fotografico del cariotipo fetale mediante appaiamento dei cromosomi omologhi.

Cariotipo su Sangue Fetale

  • Colture cellulari da linfociti di sangue fetale e allestimento dei preparati cromosomici
  • Diagnosi citogenetica con tecnica di colorazione differenziale Giemsa Standard e GTG
  • Allegato fotografico del cariotipo fetale mediante appaiamento dei cromosomi omologhi.

Cariotipo su Tessuto Abortivo

  • Colture cellulari “in situ” o a “sandwich” ed allestimento dei preparati cromosomici
  • Diagnosi citogenetica con tecnica di colorazione differenziale Giemsa Standard e GTG
  • Allegato fotografico del cariotipo fetale mediante appaiamento dei cromosomi omologhi.

Le analisi in epoca postnatale

Cariotipo su Sangue Periferico

  • Colture cellulari da linfociti di sangue periferico ed allestimento dei preparati cromosomici
  • Diagnosi citogenetica con tecnica di colorazione differenziale Giemsa Standard e GTG
  • Allegato fotografico del cariotipo fetale mediante appaiamento dei cromosomi omologhi.

Cariotipo ad alta risoluzione su Sangue Periferico

  • Colture cellulari da linfociti di sangue periferico, allestimento dei preparati cromosomici e analisi delle prometafasi
  • Diagnosi citogenetica con tecnica di colorazione differenziale Giemsa Standard e GTG
  • Allegato fotografico del cariotipo fetale mediante appaiamento dei cromosomi omologhi.

Cariotipo su Fibroblasti Cutanei

  • Colture cellulari a “sandwich” ed allestimento dei preparati cromosomici
  • Diagnosi citogenetica con tecnica di colorazione differenziale Giemsa Standard e GTG
  • Allegato fotografico del cariotipo fetale mediante appaiamento dei cromosomi omologhi.

Analisi Citogenetica Frequenze Rottura

  • Colture cellulari da linfociti di sangue periferico e allestimento dei preparati cromosomici
  • Tecnica di colorazione Giemsa e analisi di 100 metafasi.

Citogenetica Molecolare

FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

L’ibridazione in situ basata su un legame selettivo di sonde di DNA, coniugate con coloranti fluorescenti (fluorocromi), che riconoscono sequenze complementari a quelle presenti su un cromosoma o su un segmento di cromosoma. La tecnica viene applicata in caso di sospetto clinico o quando i risultati ottenuti con le tecniche di citogenetica standard suggeriscano l’opportunità di approfondimenti diagnostici. Si utizzano:

  • Sonde centromeriche  che permettono rapidamente di evidenziare anomalie numeriche dei cromosomi
  • Sonde painting che colorano l’intero cromosoma, utili per classificare anomalie cromosomiche strutturali.
  • Sonde a sequenza unica (locus-specifiche) che consentono di riconoscere specifici loci evidenziando delezioni e/o duplicazioni submicroscopiche di materiale cromosomico.
  • Sonde telomeriche, che identificano specificamente le regioni subtelomeriche presenti alle estremità  dei cromosomi.

Questa metodica offre una maggior risoluzione rispetto al cariotipo convenzionale, per una miglior caratterizzazione di anomalie strutturali non comuni che includono sindromi da microdelezioni, duplicazioni e traslocazioni criptiche, riarrangiamenti complessi, marcatori cromosomici.

Tuttavia questa tecnica è “targettata” ed è in grado di interrogare solo regioni di DNA  e non l’intero genoma.

ANALISI DI array-CGH (array based – Comparative Genomic Hybridization)

L’ Array-CGH viene utilizzata per analizzare lo sbilanciamento del numero di copie di sequenze genomiche lungo l’intero genoma in un unico esperimento e ad una risoluzione di molto superiore a quella possibile con le tradizionali tecniche di citogenetica su metafasi. Questa nuova tecnologia è basata sull’uso di un campione di DNA test e uno di controllo, marcati con fluorocromi diversi e ibridati contemporaneamente a DNA targets legati (“spottati”) su un supporto di  vetro.

Limite: non è in grado di evidenziare mosaicismi diluiti, poliploidie e riarrangiamenti cromosomici strutturali bilanciati.

Piattaforme utilizzate:

  • Oligonucleotide-arrays genomici (sono in grado di individuare microdelezioni/micro duplicazioni – CNVs – lungo tutto il genoma)
  • SNP-array genomici (sono in grado di individuare CNVs, cosi’ come regioni di omozigosita’ in casi di: consanguineita’, isodisomia uniparentale, perdita di eterozigosita’)
  • Array “Targetted” (interrogano solamente regioni note, responsabili di patologie da microdelezioni/micro duplicazioni, lungo l’intero genoma)

In accordo con le linee guida internazionali, la suddivisione del laboratorio in ambienti separati garantisce l’assenza di contaminazione dei campioni. Tutte le analisi sono eseguite secondo un rigido protocollo di qualità, con controlli interni ed esterni. Per garantire una standarizzazione delle metodiche vengono utilizzati esclusivamente kit commerciali con data di scadenza del prodotto.

  • D.ssa A. Capalbo – Specialista in Genetica Medica
  • D.ssa G. Cipressa – Specialista in Genetica Medica
  • D.ssa K. Frezza – Specialista in Genetica Medica
  • D.ssa I. Spasari – Specialista in Genetica Medica
  • D.ssa M. Iannicelli – Specialista in Genetica Medica
  • D.ssa L. Rizzo -Tecnico di Laboratorio Biomedico
  • D.ssa A. Garganese – Tecnico di Laboratorio Biomedico
  • Dr. D. Pompili – Tecnico di Laboratorio Biomedico
  • D. Cascio – Tecnico di Laboratorio
  • R. Cois – Tecnico di laboratorio

Responsabile

Nome Dott.ssa Laura Bernardini
Divisione Istituto CSS Mendel
Contatti l.bernardini@css-mendel.it